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首都醫(yī)科大學三博腦科醫(yī)院病理科 姚坤 段澤君 邊宇 馬忠 齊雪嶺

【摘要】目的 觀察少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤染色體1p /19q雜合性缺失與人IDH1-R132H突變蛋白表達的相關性，探索預測少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤化療敏感性的分子標志物。方法 選擇病理學診斷為各類型和級別的少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤75例，采用熒光原位雜交方法檢測染色體1p/19q 雜合性缺失，免疫組織化學法檢測其IDH1-R132H突變蛋白表達。結果 75例少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤1p/19q 雜合性缺失為37例(37/75，49.3%)，其中34例1p和19q同時發(fā)生缺失，1p缺失與19q缺失二者密切相關(P<0.01)。在少突膠質細胞瘤(WHO Ⅱ級)中，1p/19q 雜合性缺失檢出率比間變型少突膠質細胞瘤(WHOⅢ級)高，但差異無顯著性。少突膠質細胞起源腫瘤(WHOⅡ級和WHOⅢ級)中1p/19q雜合性缺失率高于少突-星形細胞起源腫瘤(WHOⅡ級和WHOⅢ級)(P<0.05)。而且少突膠質細胞起源腫瘤中1p/19q 雜合性缺失均為聯(lián)合缺失，1p和19q的單獨缺失僅發(fā)生在少突-星形細胞起源腫瘤中。在75例中51例(68.0%)少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤出現IDH1-R132H突變蛋白表達。少突膠質細胞起源腫瘤IDH1-R132H突變蛋白檢測陽性率高于少突-星形細胞起源腫瘤。而且少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中，IDH1突變蛋白陽性表達與染色體1p/19q 雜合性缺失均有明顯相關性(P<0.05)。結論 IDH1-R132H突變蛋白表達是預測少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤1p /19q 是否雜合性缺失的潛在分子標志物。

【關鍵詞】少突膠質細胞起源腫瘤; 少突-星形細胞起源腫瘤;1p /19q; 異檸檬酸脫氫酶-1; 相關性

[Abstract] Objective To observe the correlation between delection of chromosome 1p/19q and expression of R132H mutant IDH1 status in oligodendroglial tumors, and to explore the molecular markers forecasting chemosensitivity of oligodendroglial tumors. Methods 75 ol igodendrogl ial tumors (38 oligodendrogliomas and 37 oligoastrocytomas). Immunohistochemistry method was used to detect the expression of R132H mutant IDH1 protein， and fluorescence in situ hybridization was carried out to detect the 1p /19q deletion. Results The FISH studies demonstrated that delection of chromosome 1p/19q was in 37 cases(37/75, 49.3%), of which co-deletion were detected in 34 cases.1p and 19q LOH were closely correlated (P<0.01). In oligodendrogliomas (WHOⅡ) cases the deletion rate was slightly higher than in oligodendrogliomas (WHO Ⅲ) cases. There were no statistically significant differences. In oligodendrogliomas (WHO Ⅱand WHOⅢ) cases the deletion rate of chromosome 1p/19q was higher than in oligoastrocytomas (WHOⅡand WHO Ⅲ) cases (P<0.05).The deletion in oligodendrogliomas were all combined deletion, and 1p single deletion and 19q single deletion were only found in oligoastrocytomas. In the 75 cases，the expression of R132H mutant IDH1 was positive in 51 cases，which accounted for 68.0%.In oligodendrogliomas the expression of R132H mutant IDH1 was higher than in oligoastrocytomas. The statistical analysis indicated that there was a correlation between the expression of R132H mutant IDH1 protein and the 1p /19q combined deletion in oligodendrogliomas (P<0.05). Conclusion 132H mutant IDH1 protein is the potential molecular marker forecasting the status of 1p /19q deletion in oligodendrogliomas.

[Keywords]oligodendrogliomas ,oligoastrocytomas,1p/19q, IDH1, correlation

彌漫性膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)常見的腫瘤，包括少突膠質細胞瘤、星形細胞瘤、少突星形細胞瘤、膠質母細胞瘤等。其中少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤(包括少突膠質細胞瘤、間變少突膠質細胞瘤和少突星形細胞瘤、間變少突星形細胞瘤)是彌漫性膠質瘤中的重要類型，雖然少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤也呈彌漫性浸潤生長，但比彌漫性星形細胞瘤有更好的預后。近年來的研究顯示少突膠質細胞起源腫瘤的確存在著許多不同于其他膠質瘤類型的分子遺傳學改變。1號染色體短臂(1p)和19號染色體長臂(19q)雜合性缺失是其典型的遺傳學特征，在星形細胞瘤中這種缺失則很少發(fā)生。伴有1p 和19q雜合性缺失的少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤對化療較敏感，并有較好的預后。2008年在腦膠質母細胞瘤全基因組測序時次發(fā)現異檸檬酸脫氫酶1( isocitrate dehydrogenasel，IDH1) 基因存在突變，并且發(fā)生這種突變的繼發(fā)性膠質母細胞瘤患者的總體生存率較高。有研究表明IDH1突變存在于94%的間變型少突膠質瘤，84%的少突膠質瘤中。由于在少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中IDH1突變率較高，是一種與預后相關的因素，因此我們探討其在少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中與1p和19q雜合性缺失的關系，以期尋找到少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中與預后相關的分子標志。

材料與方法

1.病例資料：收集三博腦科醫(yī)院2011年2月至2013年1月少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤75例，在75 例少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中，男性44例，女性31例，年齡范圍1~67 歲，平均40歲。診斷標準依據2007 年中樞神經系統(tǒng)腫瘤WHO 分類。其中少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤包括：少突膠質細胞瘤(WHOⅡ級)、間變型少突膠質細胞瘤(WHOⅢ級) 、少突星形細胞瘤(WHOⅡ級)和間變型少突星形細胞瘤(WHOⅢ級)4種。標本經中性甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，每個組織連續(xù)切片4 張，厚度為4 μm，1 張進行HE 染色用于復查確認，1張采用免疫組織化學方法檢測IDH1-R132H突變蛋白表達，2 張采用熒光原位雜交(FISH)法檢測1p和19q 雜合性缺失。免疫組織化學一抗為鼠抗人IDH1-R132H 抗體(德國Dianova公司);探針為LSI 1p36/LSI 1q25 and LSI 19q13/19p13 Dual Color Probe(美國Vysis公司)。

2.免疫組織化學檢測及結果判斷：參照免疫組織化學試劑盒操作說明進行，石蠟切片常規(guī)脫蠟，過氧化物酶阻斷溶液阻斷，非免疫性動物血清封閉，微波爐抗原修復，PBS 漂洗后一次滴加鼠抗人IDH1-R132H 抗體(德國Dianova公司)4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗37℃ 20 min，鏈酶親和素-過氧化物酶溶液10 min，PBS 漂洗后DAB 顯色，中性樹膠封片，晾干，顯微鏡下觀察。免疫組織化學結果判斷由病理科醫(yī)師完成，結果判定計算每個高倍鏡視野內陽性細胞占總觀察腫瘤細胞的百分數，取其平均值定義為該標本陽性細胞的百分比，IDH1突變蛋白陽性細胞數 0～10%(-)， 11%～25%(+);26%～50%(++);>50%(+++)。陽性細胞為胞漿著色，呈棕黃色。

3.F I S H檢測及結果判斷：采用FISH探針LSI lp36/1q25SGn probe和LSI 19p13/19q13 SGn probe(美國Vysis公司)。參照探針說明書進行實驗：石蠟切片二甲苯脫蠟處理后自然晾干，預處理液80℃ 30min，去離子水洗1min，緩沖液洗5 min，重復洗2×SSC，37℃胃蛋白酶消化15-20 min，2×SSC洗滌l min;切片放入事先在72℃±1℃預熱的變性液中6 min，2×SSC洗滌1min，梯度酒精脫水并自然晾干。避光在雜交區(qū)域處加入10 μL探針并蓋上蓋玻片，加蓋22×22 mm蓋玻片并用橡膠水泥膠封固蓋玻片周邊，將切片放入37℃預熱濕盒中蓋緊蓋子，孵育過夜(17 h)，加雜交后緩沖洗液到兩個立式染色缸中，其中一個在72℃±1℃水浴箱中預熱，另一個放在室溫備用，用鑷子輕輕把密封在蓋玻片周邊上的橡膠水泥膠拉起，然后去掉橡膠水泥膠，將切片浸到室溫存放的雜交后緩沖洗液中漂洗掉蓋玻片。用吸水紙吸掉切片邊緣多余的緩沖液，將切片浸到72℃±1℃雜交后緩沖洗液2 min。再在室溫清洗30 s，將切片從緩沖洗液中移出，豎立放于暗處，晾干切片。加10μL對比染色的DAPI到切片的靶區(qū)蓋上蓋玻片。避光靜置15 min，在熒光顯微鏡(BX-51，日本Olympus公司)下觀察、采集圖像。雜交玻片保存于-20℃。熒光原位雜交結果由病理科醫(yī)師完成，結果判定選擇細胞核大小一致、核的邊界完整、DAPI 染色均一、細胞核孤立無重疊、對照信號清晰的腫瘤細胞。每例標本隨機計數200 個腫瘤細胞，1p36 和19q13分別在兩張玻片上檢測，其中1p36 檢測探針用紅色熒光標記，其對照1q25檢測探針用綠色熒光標記;19q13檢測探針用紅色熒光標記，其對照19p13 檢測探針用綠色熒光標記。紅色信號=綠色信號的細胞評判為正常細胞， 紅色信號<綠色信號的細胞評判為缺失細胞。1p36>30%為陽性。19q13 雜合性缺失評判：缺失細胞/正常細胞 比值>30%(圖1，2)。同一標本1p36和19q13同時缺失，即1p /19q 聯(lián)合雜合性缺失。

4.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。用Kruskal-Wallis 秩和檢驗來分析組間IDH1R132H突變蛋白表達差異，并用Spearman，Pea r son, Kenda l l 等系數進行了Bivariate Correlations的相關性分析， 并作了Binary Logistic的回歸與預測，P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

75例少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中，少突膠質細胞起源腫瘤38例，其中WHOⅡ級(圖1A)和WHOⅢ(圖2A)各占19例，少突-星形細胞起源腫瘤37例，WHOⅡ級(圖3A)15例，間變少突星形細胞瘤(WHOⅢ級)22例。

1.1p/19q雜合性缺失檢測(表1)：75例少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中共檢出37例(49.3%)1p和/或19q雜合性缺失，其中34例1p雜合性缺失同時伴19q雜合性缺失，二者密切相關(P<0.01)。在少突膠質細胞起源腫瘤(包括WHOⅡ級和WHOⅢ級)中，1p/19q雜合性缺失28例(圖1B,1C;圖2B,2C)，缺失率73.7%(28/38例)。在少突-星形細胞起源腫瘤中，1p/19q雜合性缺失為9例(圖3B,3C)，缺失率24.3%(9/37)，少突膠質細胞起源腫瘤1p/19q缺失率高于少突-星形細胞起源腫瘤(WHOⅡ級和WHOⅢ級，P<0.05)。少突膠質細胞起源腫瘤中1p和19q均為聯(lián)合雜合性缺失，單獨缺失僅發(fā)生在少突-星形細胞起源腫瘤中。1p或19q單獨雜合性缺失分別占少突-星形細胞起源腫瘤的2.7%(1/37)和5.4%(2/37)。

2.IDH1-R132H突變蛋白檢測(表1)：68.0%(51/75)的少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤出現IDH1-R132H突變蛋白陽性表達。少突膠質細胞起源腫瘤(WHOⅡ級和WHOⅢ級)檢出29例IDH1-R132H突變蛋白表達(76.3%)(圖1D,2D)，其中間變型少突膠質細胞瘤14例，少突膠質細胞瘤15例，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。在少突-星形細胞起源腫瘤中22例(59.5%，22/37)是陽性表達，其中間變型少突星形細胞瘤13例，少突星形細胞瘤(WHOⅡ級)9例(圖3)，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。少突膠質細胞起源腫瘤(WHOⅡ級和WHOⅢ級)IDH1-R132H突變陽性的29例，略多于少突-星形細胞起源腫瘤(WHOⅡ級和WHOⅢ級)突變陽性的22例，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。

3.1p/19q 聯(lián)合雜合性缺失與IDH1-R132H突變蛋白表達的關系：在1p /19q 聯(lián)合雜合性缺失的28例少突膠質細胞起源腫瘤中，28例(100%)均為IDH1-R132H突變蛋白陽性表達(圖1，2)。在1p/19q 聯(lián)合雜合性缺失的6例少突-星形細胞起源腫瘤中，6例均為IDH1-R132H突變蛋白陽性表達(表1)。將IDH1突變蛋白陽性細胞數<10%定義為陰性表達，將IDH1突變蛋白陽性細胞數≥10%均定義為陽性表達。檢測1p/19q 聯(lián)合雜合性缺失與否與IDH1-R132H突變蛋白表達做相關性分析。發(fā)現在少突膠質細胞起源腫瘤和少突-星形細胞起源腫瘤中1p/19q 聯(lián)合雜合性缺失與IDH1-R132H突變蛋白的表達明顯正相關(P<0.05)。

▲圖1A:少突膠質細胞瘤，WHOⅡ級;B：1p缺失;C:19q缺失;D: IDH1R132H突變蛋白表達強陽性

▲圖2A:間變性少突膠質細胞瘤，WHOⅢ級;B：1p缺失;C:19q缺失;D:IDH1R132H突變蛋白表達強陽性

▲圖3A:少突星形細胞瘤，WHOⅡ級;B：1p缺失;C:19q缺失;D: IDH1R132H突變蛋白表達陽性

討論

少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤多在周圍腦組織侵襲浸潤生長，難以徹底切除，術后的進一步放化療十分重要。但在實際臨床工作，不同的患者對化療的敏感性各異。目前研究發(fā)現，與少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤化療敏感性密切相關的是1p /19q雜合性缺失，且在典型少突膠質細胞起源腫瘤中1p缺失常常與19q缺失同時存在。有報道發(fā)現存在1p /19q 聯(lián)合雜合性缺失的間變型少突膠質細胞瘤對PVC(丙卡巴肼，洛莫司汀，長春新堿)化療敏感，平均生存期可達10年，認為間變少突膠質細胞瘤存在兩種具有不同基因改變的的分子亞型，這兩種類型有著完全不同的生物學行為。Bauman等發(fā)現放療對1p雜合性缺失者敏感，中位生存期55個月，缺乏1p雜合性缺失者，中位生存期僅半年。因此，1p /19q雜合性缺失是指導臨床醫(yī)師選擇少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤治療方法及判斷預后的較好分子指標，對于少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤術后治療有重要意義。有報道在少突膠質細胞起源腫瘤中1p/19q雜合性缺失率為74%。本組病例少突膠質細胞起源腫瘤中1p/19q 的雜合性缺失率為73.7%，與上述報道非常相近。少突膠質細胞起源腫瘤很少表現為單獨1p或19q缺失，而非少突膠質細胞起源腫瘤中單獨1p或19q雜合性缺失相對常見。本組病例少突膠質細胞起源腫瘤均表現1p和19q聯(lián)合雜合性缺失，3例1p 和19q單獨雜合性缺失均發(fā)生在少突-星形細胞起源腫瘤中，1p或19q單獨雜合性缺失分別占少突-星形細胞起源腫瘤的2.7%(1 /37例)和5.4%(2/37例)，而且19q單獨雜合性缺失比1p 缺失多見。文獻報道1p 和19q 的雜合性缺失在少突-星形細胞起源腫瘤中占20%~30%。本組病例少突-星形細胞起源腫瘤缺失率為24.3%，與之結論相近。研究顯示1p 和19q的聯(lián)合雜合性缺失可能是由于19p 到1q 的不平衡轉位引起的。

IDH 可促使NADP+轉變?yōu)?NADPH，NADPH 參與呼吸鏈正常進行，具有抗氧化和抑制腫瘤作用。研究顯示，75%的少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤均發(fā)生IDH1突變，其中IDH1突變均為雜合性突變累及IDH1 132 位精氨酸。Yan等進一步分析發(fā)現約 85%少突膠質細胞瘤同時出現1p/19q 缺失和IDH1基因突變。目前，免疫組織化學法檢測IDH1-R132H精氨酸突變蛋白表達可準確反應IDH1基因突變情況。樸月善等報道利用針對IDH1-R132H型突變的基因產物的抗體能夠特異性的標記腫瘤性膠質細胞，而非反應性增生的膠質細胞。在樸月善等報道的Ⅱ級和Ⅲ級膠質瘤中，含少突膠質細胞瘤成分者陽性率高于單純的星形細胞腫瘤，結合文獻這一結果間接提示IDHI突變與1p/19q 雜合性缺失以及少突膠質細胞腫瘤的發(fā)生密切相關。在本組病例中，少突膠質細胞起源腫瘤IDH1-R132H突變蛋白表達(76.3%)高于少突-星形細胞起源腫瘤IDH1-R132H突變蛋白表達(59.5%)，雖然無統(tǒng)計學意義，但結合文獻報道，單純的少突膠質細胞起源腫瘤IDH1-R132H突變蛋白表達要比其他類型膠質細胞瘤表達高。此外我們結合熒光原位雜交檢測1p /19q 雜合性缺失情況，分析IDH1-R132H突變蛋白表達與1p/19q 雜合性缺失兩者的相關性，發(fā)現兩種分子病理特征在少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中均具有顯著相關性。這一結果提示在少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中IDH1-R132H突變蛋白高表達一定程度上可預測1p /19q 雜合性缺失。目前FISH 檢測1p /19q 雜合性缺失耗時較長，費用較高，尚未廣泛推廣，因此在無法檢測1p /19q 雜合性缺失情況下，可以通過簡單易行免疫組織化學方法檢測IDH1-R132H突變蛋白的表達，有助預測少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中1p /19q 雜合性缺失，幫助少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤的預后判斷。

綜上所述，1p/19q 雜合性缺失是少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤的分子遺傳特性之一，與化療敏感和預后良好有關，IDH1-R132H突變蛋白是少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中經常存在的基因改變。本組研究結果顯示少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中1p/19q 聯(lián)合雜合性缺失常常伴隨IDH1-R132H蛋白突變，兩者具有相關性，認為在少突膠質細胞起源腫瘤及少突-星形細胞起源腫瘤中IDH1-R132H突變蛋白表達在一定程度上可以預測1p和19q 聯(lián)合雜合性缺失情況。

(參考文獻略)